一. 實(shí)驗(yàn)方法
1. 多聚賴氨酸(Poly-D-Lysine)包被培養(yǎng)板的制備:原代分離進(jìn)行前一天,用PBS緩沖液配制終濃度為0.1mg/ml的多聚賴氨酸工作液,0.22μm濾膜過濾除菌,于超凈工作臺(tái)內(nèi)吸取1ml加入六孔板內(nèi),確保覆蓋板底,靜置孵育30min后吸出(可回收反復(fù)使用2-3次),用無菌水清洗培養(yǎng)板,置于超凈臺(tái)內(nèi)晾干,照紫外過夜。
2. 次日,取出生24h以內(nèi)的SD大鼠,75%乙醇浸泡消毒5min。
3. 棉球吸干乳鼠體表的乙醇,迅速斷頭,浸泡于冰冷的含有2%雙抗的PBS緩沖液中。
4. 剪開顱骨,取出腦,轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中,逐個(gè)剝離大腦皮層并浸泡于冰冷的含有2%雙抗的D-HANKS液中。
5. 將剝離的皮層清洗兩遍,棄去液體,用眼科剪迅速將皮層剪碎至糜狀。
6. 加入2倍體積的木瓜酶(使用前用PBS稀釋至終濃度2mg/ml),放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化20min,期間用移液管吹打1-2次使之分散。
7. 消化結(jié)束后,加入10倍體積的D-HANKS液,同時(shí)加入1mg/ml的DNA酶,吹打混勻。
8. 用100μm孔徑的細(xì)胞篩過濾懸液一次,移至新的15ml離心管內(nèi),1000rpm離心5min。
9. 棄去上清,D-HANKS液重懸細(xì)胞,吹打使之分散,并用70μm細(xì)胞篩過濾一遍,轉(zhuǎn)移至新的離心管,再次1000rpm離心5min。
10. 棄去上清,用含有1%GLUT-MAX和2% B-27的Neurobasl-A培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整濃度為3×105/ml鋪于多聚賴氨酸包被的六孔板中,37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
11. 4h后換液,棄去培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞,并用PBS輕輕沖洗一遍,加入新鮮的含有1%GLUT-MAX和2% B-27的Neurobasl-A培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),后續(xù)沒3天換液。
12. 一周后神經(jīng)元*展開,可用于后續(xù)試驗(yàn)。
二. 結(jié)果與分析
1. 取材&分離
2. 細(xì)胞培養(yǎng)
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